כיצד לבצע שינוי שמרים?
אתה צריך גם כבר תאי שמרים הגדלים על צלחת עם תמצית שמרים-פפטון-אדנין-דקסטרוז או מדיה דומה.
שמרים, אורגניזם חד תאיים, אוקריוטיים, מורכבים יותר וישימים לבני אדם מאשר חיידקים, אך צומחים מהר יותר ודורשים פחות תחזוקה מאשר מודל של בעלי חיים רב תאיים. טרנספורמציית שמרים היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר בשמרים. בדומה לטרנספורמציה חיידקית 1, טרנספורמציית שמרים היא שיטה בסיסית לאלץ תאי שמרים לקחת פלסמיד (פיסה עגולה של DNA מלאכותי המכיל לעיתים קרובות גן מעניין) ולצמוח, לייצר עותקים רבים של הפלסמיד.
- 1לפני שתתחיל את השינוי שלך, ודא תחילה שיש לך מספיק מהחומרים שלך, כולל: DNA פלסמיד, DNA חד-גדילי 2, כל המאגרים (0,1M LiOAc ו- PEG3 טריים), ותקשורת (תמצית שמרים-פפטון-אדנין- אמצעי נוזלים דקסטרוזים וצלחות עם מדיה סלקטיבית). המדיה והצלחות הנוזליות ייקח הכי הרבה זמן אם אתה בחוץ.
- 2בלילה (או אחר הצהריים המאוחרים) לפני כן, הכינו תרבויות נוזליות של תאי השמרים שתהפכו לשינוי.
- 3אתה צריך גם כבר תאי שמרים הגדלים על צלחת עם תמצית שמרים-פפטון-אדנין-דקסטרוז או מדיה דומה.
- עובדים קרוב ללהבה, מעבירים 5 מיליליטר (0,17 fl oz) של תמצית שמרים נוזלית-פפטון-אדנין-דקסטרוזמדיה לצינור תרבות עם פיפטה סרולוגית.
- גרד כמות קטנה של תאים מהצלחת עם קצה פיפטה, נזהר שלא לנקב את המדיה המוצקה.
- הורד בזהירות את הקצה לתוך הצינור, היזהר שלא לגעת בתאים לקיר הפנימי של הצינור.
- מצנפים את הנוזל מעלה ומטה עד שתוכלו לראות את גוש התאים בקצה מתמוסס.
- מכסים את הצינורות באופן רופף כדי להבטיח זרימת חמצן לתאים.
- דגירה של הצינורות בטלטול של 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- הסר את התרבויות מהטלטול של 30 ⁰ מלילה הקודם וסגור היטב את המכסה.
- הסר את ה- DNA פלסמיד ו- DNA חד-גדילי מהמקפיא (הם מאוחסנים בדרך כלל ב -20°C). השאירו את ה- DNA פלסמיד להפשיר בטמפרטורת החדר. מחממים את ה- DNA החד-גדילי בפלטה החמה של 95 ⁰. הפתרון אמור להיות חם מאוד (כמעט רותח) עד שמשתמשים בהליך יחיד עם DNA גדילי.
- 4שינוי שמרים: כעת עליכם להיות מוכנים להתחיל את ההליך.
לשינוי שמרים. - 5זמן משוער: מינימום 2 שעות.
- 6הגדר פלטה חמה אחת ל -95 מעלות צלזיוס (יכולה להיות בין 90 ל -97 מעלות) ואחרת ל 30 מעלות צלזיוס.
- 7הפעל את מבער הבונזן וזכור לעבוד קרוב ככל האפשר ללהבה.
- 8תייג צינורות אפנדורף נקיים. צינורות מסומנים בדרך כלל עם התוכן (פלסמיד שהוסב), תאריך וראשי התיבות של המדען.
- 9Pipet 600 ul של התרבות הנוזלית לתוך כל שפופרת eppendorf.
- 10צינורות צנטריפוגה למשך 2 דקות ב -2000 סל"ד. הקפד לאזן את הצנטריפוגה באופן שווה.
- 11הסר את תגובת שיקוע על ידי יניקת ואקום, היזהר לא למצוץ כל תאים בגדר.
- 12השעיית גלולה מחדש במאגר ליאוק 300 ul 0,1 M על ידי צנרת או מערבולת מהירה של הצינורות.
- 13צנטריפוגה שוב למשך דקה אחת בסל"ד 2000 ואבק את תגובת שיקוע.
- 14חזור על שלבים 6 ו -7 כדי לוודא שכל המדיה נשטפת מהתאים.
- 15Pipet 600 ul של חיץ PEG לתוך כל צינור. PEG הוא חומר צמיג מאוד, אז היזהר בעת פיפטה. Pipet לאט, צופה במאגר זורם מתוך הקצה. אם אתה מפטפט מהר מדי, עדיין יישאר חיץ PEG בצינור.
- 16Pipet 5 ul של DNA פלסמיד ו 10 ul של DNA חד גדילי חם לתוך כל שפופרת.
בלילה (או אחר הצהריים המאוחרים) לפני כן, הכינו תרבויות נוזליות של תאי השמרים שתהפכו לשינוי. - 17דגירה את הצינורות על הפלטה החמה 30,, בין 30 דקות לילה.
- 18הלם את הצינורות באמבט מים של 42ᵒ למשך 15 דקות בדיוק.
- 19צנטריפוגה הצינורות למשך 2 דקות ב 3000 סל"ד, ואבק בזהירות את תגובת שיקוע.
- 20השעה מחדש את הגלולה במים MQ 100 ul.
- 21צלחת כל דגימה על צלחת סלקטיבית נפרדת. היזהר מזיהום בשלב זה!
- הסר את הצלחות מהחדר הקר, תן להתחמם לטמפרטורת החדר ותייג כל אחת מהן.
- השתמש במפזר תאי נירוסטה מעוקרים, טבול תחילה באתנול, ואז עבר דרך הלהבה לאידוי אתנול. תן למפזר להתקרר.
- גע בפינה בפינה של המפזר עד קצה הצלחת. אם המפזר מבצע כניסה בתקשורת, המתכת עדיין חמה מדי.
- 22Pipet ההשעיה התא מכל צינור eppendorf על הצלחת המתאימה.
- 23מורחים את התאים באופן שווה בעזרת מפזר מעוקר ביד או על פלטפורמה מסתובבת.
- 24צלחות יבשות סביב הלהבה עם מכסה בעיקר, ומשאירות שטח פתוח קטן הקרוב ביותר ללהבה. אל תשאיר יותר מדי מהצלחת פתוחה או שהזיהום יתרחש בקלות רבה יותר.
- 25ברגע שהם יבשים, יש לכסות את הצלחות ולאטום אותן בפאראפילם.
- 26דגירה את הצלחות בחממה 30ator. המושבות צריכות לצמוח תוך 3-7 ימים.
בדומה לטרנספורמציה חיידקית 1, טרנספורמציית שמרים היא שיטה בסיסית לאלץ תאי שמרים לקחת פלסמיד (פיסה עגולה של DNA מלאכותי המכיל לעיתים קרובות גן מעניין) ולצמוח, לייצר עותקים רבים של הפלסמיד.
- ללא ספק, המכשול הגדול ביותר לשינוי שמרים מוצלח הוא זיהום. כל חשיפה עודפת של תאי שמרים לאוויר הפתוח עשויה לאפשר לחיידקים מוטסים לזהם את התאים. ימי צמיחה עשויים לחלוף לפני שהזיהום נראה לעין (זיהום מתבטא בדרך כלל ככתמים מטושטשים וצבועים על לוחות השינוי), כך שאתה עלול לבזבז ימי עבודה בכל פעם בכל זמן שהטרנספורמציה שלך מזוהמת. בעבודה עם תאי שמרים יש להישאר קרוב ללהבה בכל עת ולמזער ככל האפשר את חשיפת האוויר!
- לתרבויות נוזליות:
- צינורות תרבית (שפופרת אחת תספיק לכ- 8 דגימות)
- תמצית שמרים נוזלית-פפטון-אדנין-דקסטרוז
- לשינוי שמרים:
- צורב וחלוץ של בונסן
- תרבויות נוזליות
- צינורות אפנדורף (אחד לכל דגימה)
- סמן עמיד למים לסימון
- 1000 פיפטה uL וטיפים
- חוצצים: 0,1 M LiOAc, PEG
- DNA פלסמיד
- DNA חד-גדילי
- צלחות סלקטיביות
- אתנול
- מפזר תאים
- Parafilm
- ציוד:
- צורב וחלוץ של בונסן
- סרכזת
- מערבולת
- לשאוב
- אמבט מים 42⁰ ומתלה צינור צף
- שתי פלטות חמות
- חממה 30⁰
- פלטפורמת צלחת מסתובבת (אופציונלי)
