איך מכינים ג'ל אקרילאמיד?
לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הכינו אצווה טרייה של פתרון APS בכל פעם שאתם מטילים ג'ל אקרילאמיד.
ג'לים אקרילאמיד הם מרכיב מרכזי באלקטרופורזה, תהליך הכרוך בהפרדה בין סוגים שונים של מולקולות לפי גודל. לרוב הם מורכבים מהתרכובות הכימיות אקרילאמיד וביסקרילאמיד, יחד עם חיץ בעל pH מתאים, מקור של רדיקלים חופשיים, ומייצב מיוחד, המשמש להפעלת פילמור. לאחר שג'ל הספיק להתמצק, ניתן להשתמש בו לניתוח דנ"א, רנ"א ותצורות חלבון שונות.
חלק 1 מתוך 3: ערבוב ג'ל פותר או ערימה
- 1הוסף כמות בסיסית מתאימה של ddh 2 o לבקבוקון חרוט 10 מ"ל. השתמש בפיפטה כדי לסחוט את ddH 2 O לתוך בקבוקון לאט. היזהר שלא להוסיף פחות או יותר מהכמות המתכון שאתה עוקב אחריו, אשר ישתנה בהתאם לפורמט (סוג החלבון) המסוים שאתה מתכוון לנתח.
- "ddH 2 O" הוא קיצור כימי של "מים מזוקקים כפולים", שהם מים שטוהרו עד לרמה המתאימה ליישומי מעבדה רגישים.
- כדי להכין ג'ל ריצה של 12%, למשל, היית מתחיל עם 1650μl של ddH 2 O. מיקרוליטר (μl) הוא מדידה נוזלית קטנה מאוד המקבילה למיליון ליטר.
- 2עקוב אחר ריכוז מתאים של נתרן דודציל סולפט (SDS). השתמש בפיפטה נפרדת ונקייה כדי להעביר את ה- SDS לבקבוקון הערבוב שלך. ה- SDS "יסווה" את המטען הפנימי של חלבוני הבדיקה שלך, וייתן לכולם יחס טעינה-מסה דומה. כאשר מריחים שדה חשמלי על הג'ל, הדבר יגרום לחלבונים השונים לנדוד לעבר האנודה בקצב שונה בהתבסס על מסתם.
- עברו לפיפטה טרייה בכל פעם שתוסיפו רכיב חדש לג'ל.
- 3שלבו פתרון של 30% אקרילאמיד. פתרון acrylamide סטנדרטי מורכב של הבידודים acrylamide חדורים מים טהורים. תמיסת האקרילאמיד תשמש מטריצה להפרדת חלבונים וחומצות גרעין.
- במידת הצורך, תוכלו להכין פתרון משלכם ב -30% על ידי שילוב של 30% (w / v) אקרילאמיד ו- 1,0% N, N'-methylene-bisacrylamide בריכוז מתאים של מים.
אזהרה: ללבוש כפפות תמיד בכל עת שאתה עובד עם תערובות אקרילאמיד וביסקרילאמיד. שני הפתרונות הם נוירוטוקסינים שעלולים להיות בעלי השלכות מזיקות קשות אם הם נקלטים בעור חשוף.
- 4הוסף את הכמות הדרושה של 1,5 מ 'טריס- hci ph 8,8. שוב, השתמשו בפיפטה טרייה והקפידו להוסיף את הכמות המדויקת. תוספת של טריס- HCI תבטיח שהרכיבים המעורבים בתערובת הג'ל שלך יישארו ב- pH קבוע.
- טריס- HCI (קיצור של "טריס (הידרוקסימתיל) אמינמתאן הידרוכלוריד") הוא סוג של חיץ הנפוץ בשימוש בהליכים כימיים ובניסויים.
- 5להחדיר 10% אמוניום פרסולפט (APS). APS הוא חומר חמצון חזק המשמש לעתים קרובות כזרז משותף בכימיה פולימרית. יחד עם TEMED, הוא חיוני ליזום פילמור, תהליך יצירת קשרים מורכב שיגרום לתערובת הנוזלים להתמצק לג'ל.
- לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הכינו אצווה טרייה של פתרון APS בכל פעם שאתם מטילים ג'ל אקרילאמיד.
- 6הוסף tetramethylethylenediamine (TEMED) אחרון לזרז את התגובה. לאחר שתסיים לקרב את שאר הרכיבים שלך, לחץ על ה- TEMED למעלה. TEMED הוא הזרז העיקרי המשמש באלקטרופורזה ג'ל. זה יתחיל פילמור ברגע שהוא נכנס לתערובת, אז היה מוכן להטיל את הג'ל שלך מיד לאחר הוספתו.
- זה קריטי כדי להוסיף את TEMED האחרון, מאז זה אחראי לקביעת התגובה תנועה.
- ניתן לחזור על ההליך המתואר כאן (כמו גם על סדר ההוספה) כדי להכין ערימות ג'לים - ההבדל היחיד יהיה הכמויות המדויקות של כל רכיב.
תמיסת אקרילאמיד סטנדרטית מורכבת מבודדי אקרילאמיד המושרים במים טהורים במיוחד.
חלק 2 מתוך 3: הרכבת מנגנון הליהוק
- 1מניחים את הצלחת הדקה על הצלחת העבה ומיישרים את קצוות שתי הלוחות. אלקטרופורזה ג'ל מתנהלת בתוך מעטפת המורכבת משתי לוחות זכוכית נפרדות, אחת מהן עבה מעט יותר מהשנייה. כדי להתחיל בבניית מעטפת זו, ערם את הצלחת "הקצרה" על גבי הצלחת "הגבוהה" עם הלוח הדק יותר.
- העבה מבין שתי הלוחות כוללת מרווחים מובנים היוצרים תא צר כאשר הם מונחים על הצלחת הדקה יותר.
- 2החלק את הלוחות הנערמים לחריץ בחלק העליון של מסגרת היציקה. הפלטה הקצרה צריכה להיות פונה לצד הקדמי של המסגרת, כאשר הפלטה הגבוהה והמרווחים נראים מהצד הנגדי. ברגע שהלוחות מונחים היטב בתוך המסגרת, הניף את "השערים" הצירים משני צידי המסגרת לאחור כדי להדק אותם במקום.
- בדוק כדי לוודא שהקצה התחתון שנוצר על ידי זוג הלוחות המיושרים מקביל לחלוטין הן לתחתית מסגרת היציקה והן למשטח העבודה הבסיסי.
- מסגרת היציקה מעוצבת בדרך כלל מפלסטיק ירוק, מה שהופך אותה להבחנה מיידית משאר המכשירים.
- 3הגדר את מסגרת הליהוק לגוף מעמד הליהוק. הרם את המהדק בצורת U בחלקו העליון של המעמד, הכנס את המסגרת עם הלוח הקצר כלפי חוץ, ואז הנמיך אותה שוב כדי לנעול את המסגרת כלפי מטה. בדוק את החיבור בין שתי החלקים כדי לוודא שהמסגרת לא זזה או מסתובבת בתוך המעמד.
- לאחר ההרכבה, צריך להיות מספיק מקום בין שתי הצלחות לצינור בתערובת הג'ל שלך.
טיפ: אם תרצו, תוכלו לבדוק את החדר לאיתור נזילות פוטנציאליות על ידי צנרת של כ -1 מיליליטר (0,034 fl oz) של מים ללא יונים למרווח בין הצלחות. כשתהיה מרוצה, רוקן את המים בזהירות או החלק גיליון נייר סינון לתוך הפער כדי לספוג את עודפי הנוזלים.
תמיסת האקרילאמיד תשמש מטריצה להפרדת חלבונים וחומצות גרעין.
חלק 3 מתוך 3: לשפוך את הג'ל שלך
- 1צנח את תערובת הג'ל הנוזלית שלך אל הפתח בחלק העליון של החדר. השתמש בפיפטה בזכוכית ובנורה כדי להוסיף את התערובת עד שהיא אחידה עם קו המילוי המצוין בחלק החיצוני של מעטפת הזכוכית. אל תדאגי לגבי בועות אוויר כלשהן שתראה בתוך המעטפת - אתה תתמודד איתן לפני שתאפשר לג'ל להתמחור לחלוטין.
- אם הציוד בו אתה משתמש אינו מכיל קו מילוי, מדד למטה בערך סנטימטר אחד (0,39 אינץ ') מהחלק העליון של "חלון" הזכוכית הנראה בתוך מסגרת היציקה והדבק שם באמצעות סמן לבד.
- 2יוצקים שכבת אלכוהול אתילי, איזופרופנול או n- בוטנול כדי להסיר את התערובת. מלא פיפטה טרייה באלכוהול שבחרת וסחט אותה לתא מעט-מעט באמצעות תנועה חלקה קדימה ואחורה. המשך להזרים אלכוהול עד שהוא ממלא את החלל שנותר בתוך המעטפת, בערך 1 ס"מ (0,39 ס"מ).
- תמיסת כיסוי אלכוהול לא רק תסייע בהמסת חמצן כלוא אלא גם תמנע מכל גזים סביבתיים אחרים למצוא את דרכם לתערובת הג'ל המוגמרת.
- בדרך כלל אין צורך לנקות ג'לים מוערמים מכיוון שהשכבות הנפרדות מתפקדות כמטריצה רציפה אחת ומאפשרות לדגימות חלבון לעבור דרך הג'ל באופן חופשי בהשפעת חשמל.
אלטרנטיבה: מסיר את תערובת הג'ל הנוזלית תחת ואקום למשך 15-20 דקות לפחות לפני שתוסיף את ה- APS ואת TEMED.
- 3אפשר לג'ל להסתדר למשך מינימום 20-30 דקות בטמפרטורת החדר. עכשיו, כל שנותר לעשות הוא להגדיר טיימר ולהשאיר את הג'ל שלך לשבת ללא הפרעה למשך חצי שעה בערך. במהלך תקופה זו, הוא יסתיים בפילמור, ויתקשה בהדרגה לג'ל צפוף.
- הימנע מלהזיז, לגעת, להוסיף משהו לג'ל או להפריע לו בדרך כלשהי בזמן שהוא עסוק בפולימריזציה.
- אם הזמן מאפשר, תוכלו להאריך את זמן הפילמור המוקצב ל-45-60 דקות, רק כדי להיות בטוחים שלג'ל הייתה הזדמנות להתמצק לחלוטין.
- 4מסננים או סופגים את תמיסת כיסוי האלכוהול לאחר שהג'ל הסתיים. שפוך את האלכוהול לכיור כימי או לשקע מתאים לפינוי פסולת נוזלית, או השתמש בגיליון נייר סינון כדי לנקות אותו. כעת יש לך אפשרות להשתמש מיד בג'ל שלך או לאחסן אותו לניתוח עתידי.
- ישנם כימאים שממליצים גם לשטוף את המשטח העליון של הג'ל היצוק בכמות קטנה של מים ללא יונים.
- צלוחיות ארלנמאייר שימושיות גם לערבוב תמיסות אקרילאמיד וג'לים, מכיוון שצווארם המחודד מגביל את כמות האדים שעלולים להרעיל שמותר לברוח.
- ודא שצלחות הזכוכית שלך נקיות ונקיות מסדקים, שבבים או נזקים אחרים לפני שתתחיל ביציקה.
- חלק מהסיכונים הנלווים לעבודה עם אקרילאמיד כוללים הרעלת מערכת העצבים, נזק או השפעות חריגות לאברי הרבייה, הפרעה לייצור ההורמונים וסיכון מוגבר לסרטן.
- רבים מהכימיקלים המשמשים להכנת ג'לים אלקטרופורזים הם קאוסטיים בדרגות שונות ויכולים לגרום לגירוי קל עד חמור אם הם באים במגע עם העור שלך.
במידת הצורך, תוכלו להכין פתרון משלכם ב -30% על ידי שילוב של 30% (w / v) אקרילאמיד ו- 1,0% N, N'-methylene-bisacrylamide בריכוז מתאים של מים.
- ג'ל חרוטי 10 מ"ל או בקבוק ארלנמאייר
- פיפטה
- כפפות לטקס או ניטריל
- ddH 2 O
- נתרן דודציל סולפט (SDS)
- תמיסת 30% אקרילאמיד
- 1,5 מ 'טריס- HCI pH 8,8
- אמוניום פרסולפט (APS)
- Tetramethylethylenediamine (TEMED)
- צלחת קצרה
- צלחת מרווח גבוהה
- עובש יציקה
- עמדת יציקה
- פיפטה ונורה מזכוכית
- אלכוהול אתילי, איזופרופנול או n- בוטנול
- שעון עצר
- מים יונים (לא חובה)
- נייר סינון (אופציונלי)
- סמן בעל פינה (אופציונלי)
