כיצד לבצע ניתוח ספקטרופוטומטרי?
לפני ביצוע ניתוח ספקטרופוטומטרי, הפעל את המכונה כך שתוכל להתחמם למשך 15 דקות לפני הפעלת דגימות. בינתיים, צנור את חומר הדגימה שלך לקובטה אחת, ופתרון בקרה, כמו מים, לשני. לאחר מכן, הגדר את אורך הגל הרצוי על המכונה והנח את הקובטה עם פתרון הבקרה בפנים כדי לכייל אותה. לאחר מכן, הגדר את המחט לאפס לפני שתחליף את פתרון הבקרה לדוגמא שלך. לאחר 10 שניות קרא את ערכי האחוזים והקליט אותם לפני הסרת הדגימה. לקבלת טיפים מבודק המדע שלנו כיצד להשתמש בתוצאות הניתוח שלך לחישוב העברה וספיגת המדגם, המשך לקרוא!
לפני ביצוע ניתוח ספקטרופוטומטרי, הפעל את המכונה כך שתוכל להתחמם למשך 15 דקות לפני הפעלת דגימות.
ספקטרופוטומטריה היא טכניקה ניסיונית המשמשת למדידת ריכוז המומסים בתמיסה ספציפית על ידי חישוב כמות האור הנספגת באותם המומסים. טכניקה זו חזקה מכיוון שתרכובות מסוימות יספגו אורכי גל שונים של אור בעוצמות שונות. על ידי ניתוח האור העובר בתמיסה, ניתן לזהות חומרים מומסים מסוימים בתמיסה וכמה מרוכזים החומרים הללו. ספקטרופוטומטר הוא המכשיר המשמש לניתוח פתרונות במסגרת מחקר מעבדה.
חלק 1 מתוך 3: הכנת הדגימות
- 1הפעל את הספקטרופוטומטר. רוב הספקטרופוטומטרים צריכים להתחמם לפני שהם יכולים לתת קריאה מדויקת. הפעל את המכונה והניח לה לשבת במשך 15 דקות לפחות לפני שתפעיל דוגמאות כלשהן.
- השתמש בזמן החימום להכנת הדגימות שלך.
- 2נקו את הקוביות או המבחנות. אם אתה עושה מעבדה לבית הספר, ייתכן שאתה משתמש במבחנות חד פעמיות שלא צריך לנקות. אם אתה משתמש בקוברות או במבחנות לשימוש חוזר, וודא שהן מנוקות כראוי לפני השימוש. שטפו כל קובט ביסודיות במים ללא יונים.
- היזהר עם קוביות מכיוון שהן יכולות להיות יקרות למדי, במיוחד אם הן עשויות זכוכית או קוורץ. קוביות קוורץ מיועדות לשימוש בספקטרופוטומטריה הנראית לעין.
- בעת הטיפול בקובטה, הימנע מלגעת בדפנות שהאור יעבור דרכן (בדרך כלל, הצדדים הברורים של המכולה). אם אתה נוגע בטעות בצדדים אלה, נגב את הקובטה למטה בעזרת קימוויפ (שנוסחו למניעת גירוד הזכוכית).
- 3טען את הנפח הנכון של הדגימה לקובטה. לחלק מהקובטות נפח מרבי של 1 מיליליטר (מ"ל) ואילו מבחנות יכולות להיות בנפח מקסימלי של 5 מ"ל. כל עוד הלייזר המפיק את האור עובר דרך הנוזל ולא חלק ריק של המיכל, תקבל קריאה מדויקת.
- אם אתה משתמש בפיפטה לטעינת הדגימות שלך, השתמש בטיפ חדש לכל דגימה כדי למנוע זיהום צולב.
כיצד קשור ספקטרופוטומטר למדד השחמה או כיצד SP יכול למדוד השחמה? - 4הכן פתרון בקרה. המכונה ריק, בתמיסת הבקרה יש רק את הממס הכימי שבו מומס המומס שיש לנתח. לדוגמא, אם היה לכם מומס מלח במים, הריק שלכם יהיה רק מים. אם צובעים את המים באדום, הריק חייב להכיל גם מים אדומים. הריק הוא בנפח זהה לזה של התמיסה שיש לנתח ולשמור באותו סוג של מיכל.
- 5נגב את החלק החיצוני של הקובטה. לפני שמכניסים את הקובטה לספקטרופוטומטר אתם רוצים לוודא שהיא נקייה ככל האפשר, כדי למנוע הפרעות של לכלוך או חלקיקי אבק. בעזרת מטלית נטולת מוך, הסר את טיפות המים או האבק העשויים להיות בחלק החיצוני של הקובטה.
חלק 2 מתוך 3: הפעלת הניסוי
- 1בחר וקבע את אורך הגל של האור לנתח את הדגימה באמצעותו. השתמש באורך גל יחיד של אור (צבע מונוכרומטי) כדי להפוך את הבדיקה ליעילה יותר. צבע האור שנבחר צריך להיות כזה הידוע כנספג באחד הכימיקלים הנחשבים במומס הבדיקה. הגדר את אורך הגל הרצוי בהתאם למפרט הספקטרופוטומטר שלך.
- במעבדה לכיתה, סביר להניח שאורך הגל יינתן לך.
- מכיוון שהמדגם ישקף את כל האור באותו הצבע כפי שהוא מופיע, אורך הגל הניסויי תמיד יהיה בצבע שונה מזה של המדגם.
- אובייקטים מופיעים כצבעים מסוימים מכיוון שהם משקפים אור באורכי גל מסוימים וסופגים את כל הצבעים האחרים. הדשא הוא ירוק מכיוון שהכלורופיל בו מחזיר אור ירוק וסופג את כל השאר.
- 2כיול את המכונה עם הריק. מכניסים את הריק לתוך מחזיק הקובט וסוגרים את המכסה. על ספקטרופוטומטר אנלוגי יהיה מסך עם מחט שנע בהתאם לעוצמת זיהוי האור. כאשר הריק נמצא, אתה אמור לראות את המחט עוברת ימינה. רשום ערך זה למקרה שתזדקק לו למועד מאוחר יותר. כאשר הריק עדיין נמצא במכונה, העבר את המחט לאפס באמצעות כפתור הכוונון.
- ניתן לכייל את הספקטרופוטומטרים הדיגיטליים באותה צורה, פשוט יהיה להם קריאה דיגיטלית. הגדר את הריק ל 0 באמצעות כפתורי הכוונון.
- כאשר אתה מסיר את הריק, הכיול עדיין יהיה במקום. כאשר מודדים את שאר הדגימות שלך, הספיגה מן הריק תגרע באופן אוטומטי החוצה.
- הקפד להשתמש בריק יחיד לכל הפעלה, כך שכל מדגם מכויל לאותו ריק. לדוגמה, אם תרוקן את הספקטרופוטומטר ואז תנתח רק חלק מהדגימות ותרוקן אותו שוב, הדגימות הנותרות יהיו לא מדויקות. תצטרך להתחיל מחדש.
מכשיר זה משמש לניתוח כימי וביוכימי, אך ניתן להשתמש בגרסה SP גם לחקר התכונות הפיזיקליות של חומר. - 3הסר את הריק ובדוק את הכיול. כשהריק מוסר המחט צריכה להישאר על 0 (אפס) או שהקריאה הדיגיטלית צריכה להמשיך לקרוא 0. הכנס את הריק חזרה למכונה וודא שהמחט או הקריאה לא משתנים. אם המכונה מכוילת כראוי עם הריק שלך, הכל צריך להישאר על 0.
- אם המחט או הקריאה אינם 0, חזור על שלבי הכיול עם הריק.
- אם אתה ממשיך להיתקל בבעיות, פנה לסיוע או שהמכונה נבדקת לצורך תחזוקה.
- 4מדוד את הספיגה של המדגם הניסויי שלך. הסר את הריק והניח את הדגימה הניסיונית למכונה. החלק את הקובטה לחריץ המיועד וודא שהיא עומדת זקופה. המתן כ -10 שניות עד שהמחט יציבה או עד שהמספרים הדיגיטליים יפסיקו להשתנות. רשום את הערכים של% העברה ו / או ספיגה.
- הספיגה מכונה גם הצפיפות האופטית (OD).
- ככל שמועבר יותר אור, כך הדגימה סופגת פחות אור. באופן כללי, ברצונך להקליט את ערכי הספיגה אשר בדרך כלל יינתנו כעשרוני, למשל, 0,43.
- אם אתה מקבל תוצאה רחוקה (כגון 0,900 כאשר השאר הם סביב 0,400), לדלל את הדגימה ולמדוד את הספיגה שוב.
- חזור על הקריאה עבור כל מדגם בודד לפחות שלוש פעמים וממוצע ביחד. זה מבטיח קריאה מדויקת יותר.
- 5חזור על הבדיקה באורכי גל רצופים של אור. במדגם שלך עשויות להיות מספר תרכובות לא ידועות שישתנו בספיגתן בהתאם לאורך הגל. כדי למנוע אי וודאות, חזור על קריאותיך במרווחי זמן של 25 ננומטר על פני הספקטרום. זה יאפשר לך לזהות כימיקלים אחרים החשודים כמומס.
חלק 3 מתוך 3: ניתוח נתוני הספיגה
- 1חשב את העברת הספיגה והספיגה של המדגם. העברה היא כמה מהאור שעבר דרך הדגימה הגיע לספקטרופוטומטר. ספיגה היא כמה מהאור נספג על ידי אחד הכימיקלים במומס. לספקטרופוטומטרים מודרניים רבים יש תפוקה של העברה וספיגה, אך אם רשמתם עוצמה, תוכלו לחשב את הערכים הללו.
- המעבר (T) נמצא על ידי חלוקת עוצמת האור שעבר דרך תמיסת הדגימה עם הכמות שעברה דרך הריק. זה מתבטא בדרך כלל כעשרוני או אחוז. T = I / I 0 כאשר אני הוא עוצמת המדגם ואני 0 הוא עוצמת הריק.
- הספיגה (A) מתבטאת כשלילי של לוגריתם הבסיס 10 (אקספוננט) של ערך ההעברה: A = -log 10 T. לערך T של 0,1, ערך A הוא 1 (0,1 הוא 10 לחזק -1), כלומר 10% מהאור מועבר ו 90% נקלט. עבור ערך T של 0,01, הערך של A הוא 2 (0,01 הוא 10 לחזק -2), כלומר 1% מהאור מועבר.
לקבלת טיפים מבודק המדע שלנו כיצד להשתמש בתוצאות הניתוח שלך לחישוב העברה וספיגת המדגם, המשך לקרוא! - 2התווה את ערכי הספיגה לעומת אורכי הגל בגרף. ערך הספיגה מתוכנן על ציר ה- y האנכי מול אורך הגל של האור המשמש לבדיקה נתונה הותווה על ציר ה- X האופקי. תכנון ערכי הספיגה המקסימליים לכל אורך גל של האור שנבדק, מייצר את ספקטרום הספיגה של הדגימה ומזהה את התרכובות המרכיבות את חומר הבדיקה ואת פרופורציותיהן.
- ספקטרום ספיגה כולל בדרך כלל פסגות באורכי גל מסוימים שיכולים לאפשר לך לזהות תרכובות ספציפיות.
- 3השווה את עלילת ספקטרום הספיגה שלך לחלקות ידועות של תרכובות ספציפיות. לתרכובות ספקטרום ספיגה ייחודי ותמיד יפיקו שיא באותו אורך הגל בכל פעם שהם נמדדים. על ידי השוואת העלילות של תרכובות לא ידועות לאלה של תרכובות ידועות, תוכל לזהות את המומסים המרכיבים את הפתרון שלך.
- אתה יכול גם להשתמש בשיטה זו כדי לזהות מזהמים במדגם שלך. אם אתה מצפה לשיא ברור אחד באורך גל ספציפי ואתה מקבל 2 פסגות באורכי גל נפרדים, אתה יודע שמשהו אינו תקין במדגם שלך.
- ספקטרופוטומטר
- חומר בתמיסה לניתוח
- ממס נוסף (לתמיסה ריקה)
- מיכלים לפתרונות בדיקה וריקים (קובטות, מבחנות וכו ')
קרא גם: איך עושים פיצוץ?
שאלות ותשובות
- מהם הסוגים השונים של אלמנטים ותרכובות שנבדקו באמצעות ספקטרופוטומטר?דנ"א, רנ"א, בידוד חלבונים, טיהור חלבונים, קינטיקת אנזימים, קביעת pH אופטימלי לדגימה, קביעת ריכוזיות של דגימות לא ידועות (כמתואר לעיל) וקביעת ה- pKa של דגימות שונות.
- מדוע אתה מאפס ספקטרופוטומטר?עליך "לאפס" את הספקטרופוטומטר שלך לפני השימוש בו, כך שכל קריאות הספיגה שלך יכולות להיות להשוואה. לדוגמא, אם מדגם החלבון שלך היה מדולל במים מזוקקים, היית מאפס או "מרוקן" את הספקטרופוטומטר בעזרת מים מזוקקים בלבד, כך ניתן לייחס את ההבדל היחיד בין קריאות הספיגה לריכוז החלבון במדגם.
- כיצד אוכל להכין פתרונות לדוגמא לבדיקת ספיגתם?זה תלוי במה שאתה מחפש. כך תכין דגימה לקביעת תכולת החלבון בתמיסה. 1) תאי Lyse מניסוי במאגר תמוגה (אנו משתמשים במאגר תמוגה של SDS 4%) בצינור אפנדורף. 2) סוניק את התאים כדי לסייע בפתיחתם, ומאפשר לחלבונים מתוך התא לעבור למאגר התמוגה. 3) הרתיח דגימות ב 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. 4) צנטריפוגה הדגימות שלך ב 13000 גרם למשך 2 דקות. 5) אני מצליף באצבע על שפופרת eppendorf כדי להבטיח ערבוב נכון ואז צנטריפוגה שוב. 6) קח 10 מיקרוליטר מהמדגם שלך והוסף אותו ל- 990 מיקרוליטר מים ללא יונים כפולים. מערבולת לערבב. 7) קח את הדגימה שלך (1 מיליליטר) ומדד את הספיגה שלה בספקטרופוטומטר כמתואר לעיל.
- כיצד ניתן לכייל ספקטרומטר?מדריך למשתמש יתאר בפירוט כיצד לבצע תחזוקה ותפעול באמצעות SP. מכיוון שמכשיר זה דורש מדידה מדויקת, כמעט לכל מכשירי ה- SP המודרניים יש שגרת כיול מובנית אשר יש להפעיל לפני השימוש במכשיר. ספקטרופוטומטר (SP) הוא מכשיר המודד את כמות האור המועבר באורך גל מסוים. מכשיר זה משמש לניתוח כימי וביוכימי, אך ניתן להשתמש בגרסה SP גם לחקר התכונות הפיזיקליות של חומר. רוב הספקטרופוטומטרים מגיעים בשתי קטגוריות: מנסרה ופלים מגורדים.
- כמה זמן דוגמאות יכולות לשבת לפני קריאתן? האם אוכל למדוד את ספיגת הדגימה לאחר שעה? אם כן, מדוע?משך הזמן בו ניתן להשאיר דגימה משתנה עם ממיסים שונים. אם מדידה במשהו כמו צלחת 96 בארות, לא הייתי מחכה שעה פשוט בגלל הגורמים הסביבתיים המשפיעים על גודל מדגם כל כך קטן. אמנם אתה יכול למדוד טכנית אחרי זמן רב זה, אך אני באופן אישי מעמיד בסימן שאלה את תקפותן של כל התוצאות המתקבלות בדרך זו.
שאלות ללא מענה
- כיצד אוכל למדוד את בהירות המדגם באמצעות ספקטרופוטומטריה? כיצד אוכל להעביר גרפיקה של ספיגה לקואורדינטות CIELAB?
- כיצד אוכל להכין את המאגר?
- כיצד קשור ספקטרופוטומטר למדד השחמה או כיצד SP יכול למדוד השחמה?
תגובות (11)
- הכל מוסבר, ממש מועיל!!
- זה ממש עזר לי מאוד. תודה רבה על פרסום המאמר. אני באמת אסיר תודה.
- המצגת הציורית הקלה על ההבנה!
- לא היה לי מושג איך הניסוי הזה מתנהל, ובכל זאת אני אמור להשתמש בו לצורך עבודת הדוקטורט שלי. למרבה המזל, נקלעתי לדף זה. זה פשוט הקל על חיי.
- מאמר מדהים לסטודנטים לכימיה של AP.
- מאמר זה ברור מאוד ומובן בקלות. זה ממש מושך את העין מכיוון שהוא משתמש בתמונות לכל צעד, ולכן הוא לא משעמם את הקורא. אני אוהב את המאמר הזה וזה באמת עזר לי במשימה שלי להכין את דוח המעבדה שלי.
- כל פרט הוא יקר ערך, במיוחד בספקטרופוטומטריית קרינה UV כפולה עם דגימות נרחבות והתייחסות.
- מאוד מאוד מועיל וקל להבנה!
- מאמר זה היה מועיל לחלוטין.
- מאמר זה הסביר בקלות את השלבים המעורבים בניתוח ספקטרופוטומטרי.
- זה עזר לי להבין את הנושא.
