כיצד לחלץ DNA של פטריות חלודה המושבות על חומר צמחי?

זה מתאר הליך להפקת DNA מפטריות של מיני חלודה שהתיישבו על כל חומר צמחי. התוצר הסופי הוא תערובת של DNA בעיקר פטרייתי וכמות קטנה של DNA צמחי בתמיסה שניתן להשתמש בה בהגברה של PCR. צפוי ניסיון קודם במעבדה רטובה. הותאם מפרוטוקול היצרן.

צעדים

1

הוסף לצינורות מטריצה C של 22-25 מ"ג רקמת עלים נגועה (גודל אצבע) ו -20-25 מ"ג אדמה דיאטומית (כדור קיסם)
2

מקם דגימות ב- MP fastprep 24 homogenizer במשך 20s במהירות 4.
3

הוסף חיץ של פירוק גנומי 600μl עם פרוטאינאז K. במהירות, מערבולת כדי לערבב לחלוטין.
4

דגירה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס (60 מעלות צלזיוס) למשך שעה. הפוך כל 15 דקות לערבב.
5

תן להצטנן לטמפרטורת החדר.
6

הוסף 200μl כלורופורם. הפוך לערבב.
7

סובב במהירות הגבוהה ביותר במשך 10 דקות.
8

העבר את תגובת שיקוע (השכבה העליונה) לצינור נקי של 1,5 מ"ל. מחק את הצינור הקודם.
9

הוסף פתרון של הפשטת DNA 50μl. הפוך לערבב.
10

דגירה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס (60 מעלות צלזיוס) למשך שעה.
11

במהירות, הניחו על קרח למשך 5 דקות.
12

הוסף פתרון משקעים של 100μl. הפוך לערבב. אם לא נוצר משקע לבן, הוסף תוספת 50μL
13

סובב במהירות הגבוהה ביותר במשך 5 דקות.
14

מבלי להפריע לגלולה, העבר את תגובת שיקוע לצינור נקי של 1,5 מ"ל. מחק את הצינור הקודם.

אם הגלולה אינה נכנסת לפתרון בפני עצמה, דגירה למשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (37 מעלות צלזיוס).
15

הוסף גליקוגן מולים 5μl ו איזופרופנול 500μl.
16

הפוך לפחות 50 פעמים לערבוב.
17

סובב במהירות הגבוהה ביותר במשך 10 דקות. ייתכן שתרצה לסדר צינורות לאותו כיוון, כך שהגלולה תמיד באותו צד לאחר צנטריפוגה.
18

צריכה להיות גלולה קטנה בתחתית. שופכים את תגובת שיקוע, נזהרים מאוד מאוד שלא לעקור את גלולת ה- DNA. אם אין גלולה, עליך לנסות מחדש את החילוץ.
19

הוסף מאגר TE 100μl לגלולה. אם הגלולה אינה נכנסת לפתרון בפני עצמה, דגירה למשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (37 מעלות צלזיוס).
20

מיצוי ה- DNA הושלם. ייתכן שתרצה להעריך את האיכות / הכמות של ה- DNA על ג'ל אגרוזה.

אזהרות

לשימוש ב- PCR: הכן דילול 1:10 של מיצוי ה- DNA. אם זה לא עובד, נסה 1: 100. יותר מדי DNA יכול לעכב את תגובת ה- PCR.

קרא גם: איך להשיג דוקטורט בהיסטוריה?