כיצד לבצע מיצוי כרומוזומלי חיידקי?
הוסף 400-ul של פנול: כלורופורם (מסוכן) ואז להפוך את התמיסה למשך 2 דקות.
מיצוי כרומוזומליות בקטריאלי הוא ביצע ב סדר כדי לבודד ולטהר את הגנום של חיידקים למחקר נוסף. ניתן להשתמש ב- DNA מבודד זה לניסויים סטנדרטיים אחרים כמו PCR, רצף תפוקה גבוהה ואחרים. לא ניתן להמעיט בחשיבות של בידוד הגנום, ולכן הליך טוב וסלחני להפקת DNA חיידקי ישפר את תוצאות המעבדה. השיטה נעשית לעתים קרובות כל כך, שחברי המעבדה המנוסים ביותר ישננו בעל פה את כל השלבים.
חלק 1 מתוך 2: היום הראשון
- 1לגדל תאי חיידקים לשלב נייח בתמיסת גדילה (2,0 מ"ל) למשך הלילה במכונת טלטול מעבדה (שייקר). יש לרעידה לדגור את התאים ב 37 מעלות צלזיוס.
חלק 2 מתוך 2: יום שני
- 1צנטריפוגה 1,5 מ"ל של תמיסות תאים למשך 3 דקות ב 5700 סל"ד.
- 2פיפטה את 1,5 מ"ל של תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה, והשאיר רק את הגלולה בתחתית הצינור.
- 3השעית מחדש את הגלולה במלחת-אדה של 360 ליטר
- 4הוסף 40-ul ליזוזים לפתרון ודגירה על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים חמים למשך 35 דקות.
- 5הוסף 400-ul של פנול (מסוכן) ואז להפוך את התמיסה למשך 2 דקות.
- 6צנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות מקסימאלית.
- 7פיפטה את השכבה האורגנית של פנול (מסוכנת) (כ -400-ul) מהתמיסה.
- 8הוסף 400-ul של פנול: כלורופורם (מסוכן) ואז להפוך את התמיסה למשך 2 דקות.
- 9צנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות מקסימאלית.
- 10פיפט את הפסיכולוג את השכבה האורגנית של פנול: כלורופורם (מסוכן) (כ -400 µL).
- 11הוסף 400-ul של כלורופורם (מסוכן) ואז להפוך את התמיסה למשך 2 דקות.
- 12צנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות מקסימאלית.
- 13פיפט את התצוגה מהשכבה האורגנית של כלורופורם (מסוכן) (כ -400 ליטר). השלך בזהירות את כל פסולת הפנול והכלורופורם במיכל נפרד לפסולת מסוכנת.
פיפטה את השכבה האורגנית של פנול (מסוכנת) (כ -400-ul) מהתמיסה. - 14הוסף 800-ul של 100% etoh לשכבה המימית והפוך שוב ושוב (אמור לראות משקעים של DNA).
- 15חנות במקפיא -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להגביר את משקעי ה- DNA.
- 16צנטריפוגה למשך 15 דקות במהירות מקסימלית ופיפטה את השכבה המימית עד שנשאר רק גלולה בתחתית הצינור.
- 17השעה מחדש את הגלולה על ידי הוספת 300 ul של 70% etoh ואז צנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות מקסימאלית.
- 18Pipet החוצה את השכבה המימית עד שרק הגלולה נשארת ואז השעית את הגלולה ב 200-ul של מים.
- 19דפדף שוב ושוב על הצינור כדי להשעות את הגלולה במים. הקפד לא לסחרר כי זה יפגע ב- DNA!
- 20חנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- דאגות בטיחות: פנול וכלורופורם הם כימיקלים מזיקים ביותר הפוגעים בעור אם מתרחש מגע. היזהר בטיפול בשניהם. השלך את הפסולת ממדרגות הכוללות פנול וכלורופורם במיכל פסולת פנול וכלורופורם.
- כפפות מומלצות מאוד בעת שימוש בכימיקלים אלה. אין לבלוע אף אחד מכימיקלים אלה.
